实验室菌种的保藏方法

1、甘油悬液保存法

本方法是将菌种悬浮于甘油蒸馏水中，低温保存。这种方法比较简单，但需要低温冰箱。如果储存温度为-20，储存期约为0.5至1年，如果储存温度为-70，储存期可达10年。

将待保菌株的对数生长期培养液直接与经121蒸汽灭菌20分钟的甘油混合，使甘油终浓度为10%15%，分装于小离心管中，并放入低温冰箱保存。基因工程细菌通常通过这种方法保存。

2、冷冻真空干燥保存法

冷冻真空干燥保鲜法又称冷冻干燥保鲜法，简称冻干法。它通常采用保护剂，将待保存菌体的细胞悬液或孢子悬液制备于安瓿管中，然后将菌体样品快速低温冷冻，减压抽真空升华水分脱水样品形成完全干燥的固体细菌块。立即在真空条件下融化密封，形成厌氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，可长期保存。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

由于该方法同时具有低温、干燥和缺氧菌的保存条件，保存期长，一般为515年，成活率高，突变率低。是目前广泛使用的一种理想的保鲜方法。除不产生孢子的丝状真菌不适于此法外，病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等大多数其他微生物均可采用此法保存。但这种方法操作比较繁琐，技术要求高，需要冷冻干燥机等设备。

当需要使用保存的菌种时，可在无菌环境下打开安瓿管，将无菌培养基注入安瓿管中。固体菌块溶解后，摇匀复水，然后接种到适合菌种生长的坡度上。在适宜的温度下培养。

3、液氮冷冻保存法

液氮冷冻保存法简称液氮保存法或液氮法。它以甘油、二甲基亚砜等为保护剂，在超低温（-196）液氮中储存。其主要原理是菌株细胞由常温过渡到低温，在降到低温之前，细胞内的游离水通过细胞膜渗出，以防止细胞因游离水凝结而受损。水在膜中变成冰晶。美国ATCC菌种保藏中心采用该方法时，将菌悬液或带有菌丝体的琼脂块控制在0至-35以每分钟1/min的速率降温，然后保存于-150~-196的液氮冷箱。如果冷却速度太快，由于电池中的游离水来不及渗出电池，冰晶的形成会损坏电池。据研究，降温速度控制在（1-10）/min，细胞死亡率低；随着速度的增加，死亡率也相应增加。

液氮冷冻保存的保护剂一般有甘油、二甲基亚砜、糊精、血清白蛋白、聚乙烯唑烷、吐温80等，但最常用的是甘油（10%20%）。不同的微生物需要选择不同的保护剂，然后通过实验确定保护剂的浓度。原则上应控制在不足以引起微生物死亡的浓度。

这种方法操作简单，效率高，保存期一般可达15年以上。是目前公认的最有效的细菌长期保存技术之一。除少数对低温破坏敏感的微生物外，该方法适用于各种微生物菌种的保鲜，甚至藻类、原生动物、支原体等也可通过该方法进行有效保鲜。这种方法的另一大优点是可以采用各种培养形式的微生物进行保鲜，无论是孢子还是细菌，液体培养还是固体培养，都可以采用这种保鲜方法。缺点是需要购置超低温液氮设备，液氮消耗量较多，运行成本较高。

使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，迅速放入35-40温水中冷冻融化，无菌操作打开安瓿瓶，转移至所用相同培养基中贮藏前斜栽培。从液氮罐中取出安瓿的速度要快，一般不超过1分钟，以免其他安瓿升温影响保存质量。并且取样时必须戴上专用手套，以防意外爆炸和冻伤。

4.宿主保存方法

该方法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次体等）。它们只能寄生在活的动物、植物或其他微生物中，因此可以针对宿主细胞的特性进行保存。例如，植物病毒可以与幼嫩植物叶子的汁液混合、冷冻或干燥。噬菌体经细菌培养扩增后与培养基混合后可直接保存。动物病毒可直接用于感染相应器官或体液，然后分装于试管中，密封低温保存。

上述菌种保藏方法中，以斜面超低温冷冻法、石蜡油封法、宿主保藏法最为方便，其次为砂管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液法。保存；冷冻真空干燥和液氮超低温保存法的保存方法最为复杂，但保存效果最好。在应用中，可根据实际需要选用。

在国际知名的“美国典型培养物保藏中心”（简称ATCC）中，只采用了两种最有效的保存方法，即保存期为5至15年的冷冻干燥保存法和保存期超过15 年。采用液氮超低温保存方法，尽量减少传代次数，避免菌株变异和衰退。我国用于菌种保藏的方法有斜面超低温保存、液氮超低温保存和冷冻真空干燥保存三种。